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2004年12月13日

腫瘍特異的な標的化ベクターの開発

Targeting vectors for cancer gene therapy

札幌医科大学　分子医学研究部門　濱田洋文

Hirofumi Hamada, Department of Molecular Medicine, Sapporo Medical University

〒060-8556札幌市中央区南１条西17丁目

メール hhamada@sapmed.ac.jp

キーワード

アデノウイルスベクター、遺伝子治療、がん、骨髄幹細胞、標的化ベクター

adenoviral vector, gene therapy, cancer, bone marrow stem cell, targeting vector

Summary

がんの遺伝子治療を考える場合に最も大切になってくるのが、がんの標的化、すなわち腫瘍細胞だけを周囲の正常細胞とどうやって区別するかという課題である。腫瘍だけを見つけて、追っかけて遺伝子導入できるシステムを作ることができれば、標的化が達成できる。腫瘍の標的化を目指す遺伝子治療としては、組織特異的なプロモーター、腫瘍特異的なアポトーシス誘導、腫瘍抗原を標的とする免疫療法、腫瘍だけに感染するウイルスベクター、腫瘍特異的に増殖するウイルスベクター、などのストラテジーがある。わたしたちは、アデノウイルスのキャプシド外被タンパクに変異を導入して、遺伝子導入効率と特異性の増強を目指してきた。アデノウイルスの場合、キャプシドのファイバーが、細胞との吸着を担っている。そこで、ファイバーの先端のノブと呼ばれる領域に外来のペプチド配列を遺伝子工学的に入れて、宿主特異性を改変できる。標的に対して選択性の高い強い結合を獲得するために、どのようなリガンドないしモチーフを工夫するかが今後の研究の焦点となる。

メモランダム　「標的化とがんの多様性 (heterogeneity)」

多くのアポトーシスの機序は、腫瘍細胞と正常細胞とで同じである。そのため、腫瘍特異的な遺伝子発現のできる「標的化攻撃ベクター」を開発する必要がある。用いるアポトーシス誘導遺伝子は、できるだけその腫瘍に特異的な遺伝子異常(p53、ras、erbB2、bcr-ablなど)を標的としたい。そうやって、有効な治療法を開発してゆくと、今度は問題になってくるのが、腫瘍の多様性(heterogeneity)である。腫瘍を標的化すれば、標的化から免れる耐性細胞を選んでしまう結果になりやすい(文献５)。がん治療の研究を進める場合、どうしてもこの多様性(heterogeneity)と正面から戦うことになる。非常に手強い相手である。

はじめに

がんに対する遺伝子治療のプロトコールは多く、わが国でもいくつかの臨床研究がスタートしている（文献１）。がんの遺伝子治療を考える場合に最も大切なのが、がんの標的化、すなわち腫瘍細胞を正常細胞とどうやって区別するかという課題である。たとえば、caspase-8の遺伝子を高発現させると放射線などとの併用で非常に効果的に腫瘍細胞を殺すことができる（文献２）。P53遺伝子導入によるアポトーシス誘導（文献３、４）と同様に、少なくとも in vitro では、例外なくどんな腫瘍細胞でも殺すことができる。ところが、多くのアポトーシスの機序は腫瘍細胞と正常細胞とで同じである。単純にアポトーシス誘導遺伝子を導入するだけでは、正常細胞も死んでしまう。そこで、腫瘍特異的な遺伝子発現のできる「標的化攻撃ベクター」を開発する必要がある（文献５）。　

腫瘍の標的化を達成する遺伝子治療としては、以下に示すようないくつかのストラテジーが考えられる。１）組織特異的なプロモーターを用いて自殺遺伝子などをドライブする（文献６）。２）腫瘍に特異的なアポトーシスのメカニズムを利用する（文献７）。３）腫瘍に特異的な抗原を標的とする免疫療法（文献１）。４）腫瘍でだけ特異的に増殖するようなウイルスベクターの使用（文献８、９）。５）腫瘍の表面に存在する特異的な標的を用いて、腫瘍特異的に遺伝子導入できるようなベクターの開発（文献10、11）。当総説では、組織選択的に遺伝子導入できるようなベクターの開発に関して、現状を紹介したい。

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１．骨髄幹細胞を用いた腫瘍の標的化：

標的化の方法としては、後述するウイルスベクターを用いるもののほかにも、リポソームを用いたり、細胞を用いたりと、さまざまなアプローチが試みられている。まず、骨髄由来の間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)を用いて、悪性神経膠腫（グリオーマ）の細胞を標的化するストラテジー（文献12）を紹介する。

　MSCは、成人の骨髄液の培養で、プラスチックへの付着性を指標にして、簡単に分離できる（図１A）（文献13）。図１に示すように、MSCは脂肪細胞（B)、軟骨細胞（C)、骨細胞（D)などに、試験管内で分化させられる（文献13）。また、造血幹細胞の増殖をサポートする骨髄ストローマ細胞にも分化する（E)。最近では、ネスチン陽性の神経幹細胞（NSC)（F)や、肝臓細胞にも分化させられることがわかり、注目されている。MSCは神経や骨格筋・心筋などの虚血による傷害から組織を守る作用も明らかとなり、脳梗塞や心筋梗塞の治療にMSC細胞移植を試みる臨床研究が開始されつつある（G)。また、MSCは特定のグリオーマなどの腫瘍細胞にまとわりつくように移動する走化性がある（H）（文献12）。

図２は、ラットのグリオーマ９Ｌ細胞移植モデルである。ラットの大脳に蛍光色素のドロソフィラレッドでラベルした９Ｌ細胞（赤）を移植して３日後に、同側（図２の上のパネル）ないし反対側（図２の下のパネル）の大脳に、GFPでラベルしたラットMSC（緑）を投与して、さらに18日後に組織を調べてみる。図のaとｃはHE染色、ｂとｄはGFPに対する免疫組織染色でMSCを染めたものである。ｅからｈは、蛍光顕微鏡で緑のMSCと赤のグリオーマ細胞の分布を見たものである。MSCはグリオーマ腫瘍塊にまとわりついて取り囲む（ｅ、ｈ）ように移動し、図のｇに示すように、正常組織に向かって浸潤転移するグリオーマ細胞を追いかけるような走化性を示す。ｄに示すように、MSCはたとえ反対側に投与されても腫瘍細胞を取り囲むように長い距離を移動する強い走化性と移動能力をもつ。グリオーマ細胞から肝細胞増殖因子（HGF）などの走化性因子が分泌されて（文献14）、MSCを呼び寄せていることが分子機序として考えられている。Nakamura, Kら（文献12）は、このMSCの性質を利用して、治療サイトカイン遺伝子導入MSC細胞を用い、グリオーマの治療が可能であることを示した。このような幹細胞を用いる標的化治療は、悪性神経膠腫のような浸潤性の高い難治腫瘍を標的化する方法として有力である。

２．腫瘍に特異的な遺伝子導入系：

私たちは、標的細胞に対して高い特異性を持ち、しかも高効率で遺伝子を導入・発現させることが可能な、標的化アデノウイルスベクターの開発を目指している。このようなベクターに、細胞増殖・アポトーシス関連遺伝子・免疫制御遺伝子などの治療遺伝子を組み込んで、がんに対して高い治療効果を得ることを目的としている。現在、アデノウイルスなどでは、受容体（ヒト５型アデノウイルスの受容体であればCAR、coxsackievirus adenovirus receptor）やインテグリンなどと結合しないキャプシド変異型を遺伝子工学的に容易に作成できるようになっている（文献15）。従って、どのようなリガンドないしモチーフを工夫して標的に対して選択性の高い強い結合を獲得するかが今後の研究の焦点である。

腫瘍だけに遺伝子導入できる特異性をベクターに付与する方法としては、二つの方法がある。ひとつは、ベクター表面抗原と結合する抗体と標的腫瘍細胞の表面抗原を認識する抗体を融合した２価のscFv抗体分子 (bispecific single chain variable region antibody fragment) などを用いてベクターの表面と腫瘍表面を架橋する方法である。腫瘍表面上に特異的に発現している受容体分子に対するリガンドとベクター表面の抗原に対する抗体とを化学的に架橋して、これを用いてベクターと腫瘍表面を架橋することも可能である。もうひとつの方法として、ウイルスベクターなどでは、ゲノムのエンベロープやキャプシドをコードする部分を遺伝子工学的に改変して腫瘍だけに感染する特異性を付与する方法がある。この方法は、ウイルスを単独で投与すればよいため、抗体などによる架橋法に比べて製剤化の手順が単純である。特に制限増殖型のウイルスとして効果を発揮させるためには、遺伝的に改変したウイルスを用いることが必須となる。

さらに、静脈ないし動脈内への注射による全身投与によって、転移腫瘍を標的化するためには、キャプシド変異型ウイルスを改良して、標的細胞に対して効率の高い遺伝子導入を達成するのみでなく、肝臓をはじめとする正常細胞への遺伝子導入が起こらないような「選択性」を与える必要がある（文献16）。

３．標的分子の候補：

　腫瘍表面の標的分子の候補としては、インテグリン分子群、ヘパラン硫酸などの糖鎖や各種の糖タンパク、ErbB-2やEGF受容体などの増殖因子受容体、メラノサイト刺激ホルモン（MSH、melanocyte stimulating hormone)やガストリン放出ペプチド（GRP、gastrin releasing peptide)などのペプチドホルモンの受容体、などが試みられている。そのほかに、Ｂ細胞やＴ細胞などの免疫担当細胞の分化抗原は良い標的候補である。また、腫瘍を持つ患者に対するオーダーメイドの治療法として、Ｂ細胞やＴ細胞由来の腫瘍細胞固有のイディオトープなども標的となるであろう。

標的可能な分子の有力候補としては、人類発祥のずっと以前からウイルスたちが受容体として使ってきた分子群も考えられる。ポリオウイルスのCD155特異性、コクサッキーウイルスA21のICAM/DAF、シンドビスウイルスの高親和性ラミニン受容体、麻疹ウイルスのSLAM/CD46など、自然に存在する各種のウイルスの細胞選択性は、比較的簡単にアデノウイルスなどのベクター系に移植できる。

４．　ファイバー変異型アデノウイルスベクター：

　図３に示すように、アデノウイルスは正20面体の12個の頂点から、３量体ファイバーが突きだしており、この先端のノブが細胞受容体との結合を担っている。HIループはノブから外に向かって飛び出しており、この部分に数十個のペプチド配列を挿入しても、ウイルスの増殖や感染性に影響のないことが多い。キャプシド変異型アデノウイルスによる遺伝子導入系に関しては、さまざまな角度から盛んに研究が進められている。

CAR受容体は多くのがん細胞でも十分に発現しており、アデノウイルスによって高い遺伝子導入効率が得られることが多い。しかし、ヒトの皮膚由来の線維芽細胞、悪性黒色腫、前立腺がん、膀胱がん、口腔領域の扁平上皮がんなどではCARの発現は低く、通常のアデノウイルスでは十分な遺伝子導入効率が得られない。これらのがん細胞に対して、RGDペプチドモチーフをファイバーのHIループに含むF/RGD変異型アデノウイルス（文献17）を用いると高い遺伝子導入効率が得られる。これらの細胞では、インテグリン分子が十分に発現しており、インテグリンを介した高い吸着が得られるためである。自殺遺伝子導入療法など、高い遺伝子導入が必要な遺伝子治療に関しては、F/RGD変異型アデノウイルスを用いることが有力なストラテジーになる。

　ファイバーのカルボキシ末端に塩基性アミノ酸のリジンを直列で20個含むF/K20変異型アデノウイルス（文献10）は、ヘパリンやヘパラン硫酸などの陰性チャージの強い細胞表面糖鎖タンパクを吸着の標的とする。CAR受容体を介して十分な遺伝子導入効率が得られるヒト膵がん、大腸がんを初め多くのがんに関してF/K20変異型は効果を示さないが、ヒト悪性神経膠腫に関しては、野生型のファイバーを有するものに比べて10倍から50倍もの高い遺伝子導入効率の増強が見られた。

　自殺遺伝子導入療法やサイトカイン遺伝子導入療法などで同じ量のウイルスを投与する場合には、変異型のウイルスを用いて導入効率が上がればそれに見合っただけの高い治療効果が期待できる。一方、副作用軽減などの目的でウイルスの投与量をできるだけ制限したい場合には、投与量を10分の1以下に減らしても従来ベクターと同等の治療効果が期待できる。ファイバー変異型のベクターでとりわけ高い治療効果が期待できるのは、制限増殖性のウイルスに組み合わせた場合である（文献11）。野生型に比べてファイバー変異型の感染効率が10倍上がれば、初期に感染した細胞内で増殖して放出されたウイルス粒子が近傍の細胞に二次的に感染するときの効率もやはり10倍上がっているわけであるから、２サイクルの感染で100倍の効果が期待できる。３サイクルならさらに大きな差となる。

５．新規標的分子の系統的探索：

上述したように、膵がん、前立腺がん、メラノーマなどの腫瘍細胞では、アデノウイルス受容体CARの発現が低いために感染しにくい場合も多い。私たちは、これらのがん細胞に選択的に遺伝子導入できるような標的化の候補分子を探索するために、抗体のFcドメインに結合するProtein AのZ33モチーフをAd5ファイバーノブHIループに持つAdv-FZ33アデノウイルスを作成した（図４）。図５の概念図に示すように、このファイバー変異型アデノウイルスと抗体を併用することによって、該当する抗原分子を発現する腫瘍細胞に高い効率で遺伝子を導入することができる。CARをほとんど発現しないヒト膵癌細胞AsPc1やヒトメラノーマ細胞A375に発現する表面分子（CD29、CD54など）に対する抗体を付着させたAdv-FZ33による遺伝子導入・遺伝子発現は、コントロール（抗体の非存在下またはコントロールIgG併用でのAdv-FZ33、ならびに野生型Ad5ファイバーAdv-Fwtのウイルス）による遺伝子導入・発現の数十倍に増強できた。また、ErbB2を高発現するヒト卵巣癌細胞（SK-OV3など）への遺伝子導入は、ErbB2抗体の併用により、選択的に著明に（EGFP遺伝子導入細胞%で、5%から90%へ）増強できた。面白いことに、図６に示すように、CD29（インテグリンb1）に対する抗体２種を用いてFZ33ベクターの遺伝子導入効率を評価したところ、HUTS21抗体では効果は弱く、SG19抗体を用いた場合に飛躍的に高い遺伝子導入効果が得られた。このほかにも、同一の抗原分子を認識するさまざまな異なった抗体間で比較すると、大きな効果の差が見られる例が多かった。このような標的化テクノロジーにおいては、標的分子種だけでなく、標的抗原と対応する個々の抗体の特性が重要であろう。

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おわりに

現在、私たちは、腫瘍細胞とZ33アデノウイルスとを架橋することによって遺伝子導入効率が高まるモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、腫瘍細胞に対して標的化の可能な表面分子と抗体の組み合わせを探索している。これらの知見をもとにして、今後さらに、ウイルス外被に修飾を施すことによって、目的とする細胞に選択的に遺伝子導入できる安全性の高い治療ベクターを作製してゆきたい。

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図１　骨髄幹細胞 (MSC)の分化	図２　ラットMSC細胞のグリオーマへの走化性
図３　アデノウイルスのファイバーの構造	図４　FZ33ファイバー変異型アデノウイルスの模式図
図５　FZ33変異型アデノウイルスを用いた標的化の概念図	図６　EGFP発現FZ33変異型アデノウイルスと抗CD29抗体を用いた標的化

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文献

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