PLL COATING

カバーグラスのpoly-L-lysineコーティング

  1. PLL solutionをカバーグラス上にのせる。（表面張力利用し一枚当たり50-70ulくらい）

  2. 室温で２０分または４℃一晩静置

  3. 蒸留水で２回程洗う。

  4. 乾燥させる。

  5. そのまま使用。

＊PLL solution > PLL stockを水で１０倍にうすめ使用。

＊PLL stock > 0.1% poly-L-lysine in borate buffer, store 1ml aliquots at -20℃

＊pH8.2 borate buffer > 13ml of 0.2M(12.4g/l) boric acid + 7ml of 0.05M(19.0g/l) borax






COLLAGEN COATING

カバーグラスのコラーゲンコーティング

  1. 70% EtOHに浸したカバーグラスを先の鋭いピンセットで取り出し、バーナーの口火でアルコールをとばしてから、3.5cm culture dish に入れる。

  2. カバーグラスにcollagen solution をのせる。（ピペットで1ー2滴くらい。表面張力利用）

  3. インキュベーターに数時間放置。

  4. collagen solution を吸引。

  5. 乾燥させ４℃で保存。

  6. 予め PBS に30分間浸してから使用。

＊collagen solution > rat tail type I collagen, 50ug/mlに調整したものが最適。





細胞の固定染色

細胞の固定染色（三高俊広博士による）

  1. 細胞のカヴァーグラスをdishごと処理。まず冷PBSで3回wash
  2. 冷EtOH(-20℃)を入れ（一度とも洗いしてから）-20℃に15分以上keep（この状態で保存可）

    または

    1. 4%PFA/PBSで（一度とも洗いしてから）室温15分
    2. PBS wash x3 （PBS中で4℃保存可、但し乾燥に注意。PFA中での保存はダメ）
    3. 0.2%Triton/PBS 50ulをカヴァーグラス上に乗せ、室温5分

  3. PBS wash x3 *
  4. 4%skim_milk/PBSで室温30分
  5. PBS wash x3 *
  6. カヴァーグラスのまわりの水分を吸引で十分に除く
  7. 一次抗体（PBSで希釈、複数混ぜて良い） 50ulをカヴァーグラス上に乗せる
  8. 乾燥しない工夫を施し、室温1時間または4℃で一晩keep
  9. PBS wash x3 (*1)
  10. 二次抗体(PBSで100倍希釈）50ulをカヴァーグラス上に乗せ室温30分（光を遮る）
  11. PBS wash x3 (*1)

    一次抗体でモノクロとポリクロを混ぜて使用した場合、二次抗体同士が結合しないよう順次結合させる(*2)

    1. 2つ目の二次抗体(PBSで100倍希釈）50ulをカヴァーグラス上に乗せ室温30分（光を遮る）
    2. PBS wash x3 (*1)

    phalloidin-rhodamine処理は全ての抗体反応が終ってからあてる(*3)
    1. phalloidin-rhodamine(PBSで希釈）50ulをカヴァーグラス上に乗せ室温1時間（光を遮る）
    2. PBS wash x3 (*1)

  12. もういちどPBS wash x3 (*1)
  13. 先の鋭いピンセットでカヴァーグラスをつかみ、キムワイプに縁をつけて水をきる
  14. PPD/90%glycerolを一滴たらしたスライドグラスにカヴァーグラスを乗せ細胞を封埋
  15. カヴァーグラスを上から押えて気砲を除く
  16. ろ紙片を小さくちぎって乗せ4℃（光を遮る）で一晩、余分なPPD/90%glycerolを吸収させる
  17. カヴァーグラスの縁をマニキュアでシーリング
  1. * PBS wash x3 -> 3回目は室温で5分間PBSに浸す。
  2. * 例えば、anti-rabbit Goat IgG FITC conjugate を先に使い、wash後 anti-mouse Rabbit IgG TRITCを使えば問題ない。
  3. * phalloidin-rhodamineがMetOHに溶かしてあるため。
  4. 4%PFA/PBS -> PBS 100mlにPFA4gを加え、ホットスターラー（80℃）で数時間まわして溶かす。濾過して不溶物を除く。4℃保存。