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　　　　　札幌医科大学医学部

　　　分子医学研究部門　　近況と話題

２００３年11月１8日

研究の概要　H.HAMADA 1981-2003

２００３年１１月１８日　　　札幌医科大学　分子医学研究部門　教授　濱田洋文

       1.　抗癌剤耐性の分子機構の解明と診断治療への応用（1984-1990）
       2.　癌をはじめとする難治疾患に対する遺伝子治療法（1990-現在）
              Ａ）癌に対する免疫遺伝子治療
              Ｂ）遺伝子治療のための基盤技術の開発
       3.　再生医学の基礎研究と臨床応用（1999-現在）
              Ａ）血管新生遺伝子治療
              Ｂ）骨髄幹細胞を用いた再生医療

現在までの研究概要　

1.　抗癌剤耐性の分子機構の解明と診断治療への応用（1984-1990）：

抗癌剤の輸送を担う分子を同定してその機構をブロックすることを目的として、耐性細胞の薬剤輸送を特異的に修飾するモノクローナル抗体を得、薬剤耐性を担う抗原分子（Ｐ糖タンパク）を同定した。Ｐ糖タンパクを精製し、リン酸化、ATPase活性について解析した。Ｐ糖タンパクは、副腎・腎・肝・消化管・脳毛細血管などの正常ヒト組織にも発現しており、有害薬物・生理的な代謝物の輸送に関与していることがわかった。Ｐ糖タンパクが臨床の癌症例でも耐性と相関していることがわかり、薬剤耐性の診断が可能となった。薬剤耐性癌に対する特異的な免疫療法が、新しい治療のアプローチと考えられ、マウス・ヒトのキメラ・モノクローナル抗体を作製して臨床応用へ向けて用意を進めた。

2.　癌をはじめとする難治疾患に対する遺伝子治療（1990-現在）：

Ａ）癌に対する免疫遺伝子治療
　サイトカイン発現腫瘍ワクチン療法：　腫瘍細胞に対して各種サイトカイン遺伝子導入を行い、ワクチン治療効果を検討した。GM-CSFとIL-4の両方を発現する腫瘍ワクチンにより顕著な治療効果が得られた。
　腫瘍抗原提示メカニズムの解析：　腫瘍ワクチンの作用標的として、抗原提示樹状細胞を考えた。大量の樹状細胞を分離培養する方法を開発し、GM-CSFプラスIL-4ワクチン効果は、樹状細胞の抗原提示を介していることを示した。さらに、樹状細胞に発現する共刺激分子並びにT細胞側のレセプターについて、cDNA の発現クローニングの結果得られたCD82を中心に解析を行った。このような共刺激分子が、腫瘍ワクチンに導入すべき遺伝子候補となる。

Ｂ）遺伝子治療のための基盤技術の開発

ａ．　薬剤感受性遺伝子や癌抑制遺伝子などを腫瘍細胞へ導入する細胞傷害誘導療法のために、（i）組織固有のプロモーター（ii）腫瘍選択的な増殖型アデノウイルス（iii）アポトーシス誘導療法、などの検討を行った。

ｂ．　ファイバー変異型アデノウイルス：　1997年には、細胞側の受容体分子との吸着を担うファイバータンパクに変異をいれたアデノウイルス作成系を確立した。ヘパランスルフェートを標的とするF/K20変異型はグリオーマ細胞に、また、インテグリンを標的とするF/RGD変異型はメラノーマ・口腔癌・膀胱癌・間葉系幹細胞(MSC)などに対して、それぞれ飛躍的に高い遺伝子導入効率を示した。現在、F/RGD変異型を用いたがんに対する遺伝子治療の臨床研究を準備中である。1999年から作製したAd40由来ファイバーをもつキメラアデノウイルスF40Sは、組織選択性の向上を目指したものである。F40SはAd5の受容体CARに結合せず、Ad5のシャフトに存在していた肝臓吸着モチーフを欠如するために、バックグラウンド遺伝子導入がきわめて低いものとなった。組織選択的遺伝子導入の標的分子候補を探索するために、抗体のFcドメインと結合するZ33ファイバー変異型F40Z33を作成した。腫瘍細胞とベクターを架橋することによって遺伝子導入効率が高まるモノクローン抗体をスクリーニングすることにより、標的化の可能な表面分子の同定と臨床への応用を目指している。

３．再生医学の基盤研究と臨床応用 (1999年から現在)　

Ａ）閉塞性動脈硬化症・虚血性心疾患に対する血管新生遺伝子治療

ａ．　アンジオポエチン(Ang-1) と血管内皮細胞増殖因子 (VEGF) の併用：　 Ang-1は、壁細胞の血管内皮細胞への接着による血管構造安定化をはじめ血管リモデリングに重要な働きを担う。私たちは、ウサギの大腿動脈結紮切離モデルを用いて、VEGFにAng-1プラスミドDNA遺伝子導入を併用し、循環動態、構築血管について検討した。Ang-1前投与群では、壁細胞により支持された太い血管が多く作られ、血管造影・血圧比・組織血流比が著明に改善し、浮腫の副作用も認められなかった。閉塞性動脈硬化症に対する臨床応用を目指して、ベクターの安全性を確認し、ＧＣＰに基づいた医師主導型臨床治験プロトコールを作成した。札幌医科大学の遺伝子治療審査委員会で2003年５月に承認を受け、2003年11月現在、札幌医科大学IRBにて審査中である。

ｂ．　虚血性心疾患の再生医療：　ラット冠動脈結紮モデルならびにラット心筋壊死モデルを用いて、虚血性心疾患に対するAng-1遺伝子導入治療（プラスミドDNA、ないしセンダイウイルスベクター）が有効であることを示した。

Ｂ）幹細胞を用いた再生医療

ａ．　骨髄ストローマ細胞株を用いた人工骨髄システム：　ヒト骨髄ストローマ細胞にテロメラーゼ遺伝子 hTERT を導入することにより、トランスフォームすることなく不死化骨髄ストローマ細胞株（以下 Stroma/hTERT）を得た。Stroma/hTERT細胞との共培養系で、造血幹細胞の増殖促進が得られた。Stroma/hTERTに Indian Hedgehog (IHH) 遺伝子を高発現した細胞株との共培養では、さらに６倍高い造血幹細胞の増幅が得られ、有望である（パテント出願中）。一方、造血前駆細胞を、Stroma/hTERTとの共培養により、大量に増殖させ、成熟赤血球や巨核球を調製した（パテント出願中）。現在、上記のような「人工骨髄」をもちいた輸血システムの実用化研究を行っている。

ｂ．　間葉系幹細胞 (MSC) の治療への応用：　
　i）　MSCの骨分化： BMP2遺伝子導入したMSCを用いて、同所性骨折治療モデルで高い骨形成が得られた。整形外科・形成外科領域への応用が期待される。
　ii)　MSCの神経分化能と高い遊走能に着目して、ラット脳梗塞モデル治療実験を試みた。BDNF遺伝子導入したMSCの移植により、脳保護・治療効果を得た。札幌医科大学の寶金・新津らと、「急性期脳梗塞に対する自己骨髄細胞静脈内投与治療」第１相臨床研究のプロトコールを作成し、現在、札幌医科大学IRB審査中である。
　iii)　MSCを静脈内投与すると、傷害を受けた中枢神経組織に特異的に集積した。脳内腫瘍治療実験で、MSC細胞はグリオーマ細胞塊の辺縁を取り巻くように拡がり、サイトカイン遺伝子導入によって強い抗腫瘍効果が得られた。グリオーマ選択的なDDSとして有望である。

主要原著論文２０編

濱田　洋文

       1.　抗癌剤耐性の分子機構の解明と診断治療への応用
       2.　癌をはじめとする難治疾患に対する遺伝子治療法
              Ａ）癌に対する免疫遺伝子治療
              Ｂ）遺伝子治療のための基盤技術の開発
       3.　再生医学の基礎研究と臨床応用
              Ａ）血管新生遺伝子治療
              Ｂ）骨髄幹細胞を用いた再生医療

抗癌剤耐性の分子機構の解明と診断治療への応用

1. Hamada, H. and Tsuruo, T. Functional role for the 170- to 180-kDa glycoprotein specific to drug-resistant tumor cells as revealed by monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7785-7789, 1986.

2. Hamada, H., Hagiwara, K., Nakajima, T. and Tsuruo, T. Phosphorylation of the Mr 170,000 to 180,000 glycoprotein specific to multidrug-resistant tumor cells: Effects of verapamil, trifluoperazine, and phorbol esters. Cancer Res., 47: 2860-2865, 1987.

3. Hamada, H. and Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180 kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance: The 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. J. Biol. Chem., 263: 1454-1458, 1988.

4. Hamada, H., Miura, K., Ariyoshi, K., Heike, Y., Sato, S., Kameyama, K., Kurosawa, Y. and Tsuruo, T. Mouse-human chimeric antibody against the multidrug transporter P-glycoprotein. Cancer Res., 50: 3167-3171, 1990.

癌に対する免疫遺伝子治療

5. Nakamura, Y., Wakimoto, H., Abe, J., Kanegae, Y., Saito, I., Aoyagi, M., Hirakawa, K. and Hamada, H. Adoptive immunotherapy with murine tumor-specific T lymphocytes engineered to secrete interleukin-2. Cancer Res., 54: 5757-5760, 1994.

6. Wakimoto, H., Abe, J., Tsunoda, R, Aoyagi, M., Hirakawa, K. and Hamada, H. Intensified antitumor immunity by a cancer vaccine that produces granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4. Cancer Res., 56: 1828-1833, 1996.

7. Shibagaki, N., Hanada, K., Yamaguchi, S., Yamashita, H., Shimada, S. and Hamada, H. Functional analysis of CD82 in the early phase of T cell activation: roles in cell adhesion and signal transduction. Eur. J. Immunol., 28(4): 1125-1133, 1998.

8. Shibagaki, N., Hanada, Yamashita, H., Shimada, S. and Hamada, H. Overexpression of CD82 on human T cells enhances LFA1/ICAM1-mediated cell-cell adhesion: functional association between CD82 and LFA1 in T cell activation. Eur. J. Immunol., 29(12): 4081-4091, 1999.

遺伝子治療のための基盤技術の開発

9. Yoshida, Y., Sadata, A., Zhang, W., Shinoura, N. and Hamada, H. Generation of fiber-mutant recombinant adenoviruses for gene therapy of malignant glioma. Human Gene Therapy, 9(17): 2503-2515, 1998.

10. Shinoura, N., Yoshida, Y., Tsunoda, R., Ohashi, M., Zhang, W., Asai, A., Kirino, T. and Hamada, H. Highly augmented cytopathic effect of a fiber-mutant E1B-defective adenovirus for gene therapy of gliomas. Cancer Res., 59(14): 3411-3416, 1999.

11. Shinoura, N., Yoshida, Y., Nishimura, M., Muramatsu, Y., Asai, A., Kirino, T. and Hamada, H. Expression level of Bcl-2 determines anti- or pro-apoptotic function. Cancer Res., 59(16): 4119-4128, 1999.

12. Shinoura, N., Muramatsu, Y., Nishimura, M., Yoshida, Y., Saito, A., Yokoyama, T., Furukawa, T., Horii, H., Hashimoto, M., Asai, A., Kirino, T. and Hamada, H. Adenovirus-mediated transfer of p33ING with p53 drastically augments apoptosis in gliomas. Cancer Res., 59(21): 5521-5528, 1999.

13. Motoi, F., Sunamura, M., Ding, L., Duda, DG., Yoshida, Y., Zhang, W-P., Matsuno, S. and Hamada, H. Effective gene therapy for pancreatic cancer by cytokines mediated by restricted replication-competent adenovirus. Human Gene Ther., 11(2): 223-235, 2000.

14. Nakamura T, Sato K. and Hamada H. Effective Gene Transfer to Human Melanomas via Integrin-Targeted Adenoviral Vectors. Hum. Gene Ther., 13(5): 613-626, 2002.

15. Nakamura T, Sato K and Hamada H. Reduction of natural adenovirus tropism to the liver by both ablation of fiber-Coxsackievirus and adenovirus receptor interaction and use of replaceable short fiber. J. Virol., 77(4): 2512-2521, 2003.

血管新生遺伝子治療

16. Yamauchi, A, Ito, Y, Morikawa, M, Kobune, M, Huang, J, Sasaki, K, Takahashi, K, Nakamura, K, Dehari, H, Niitsu, Y, Abe, T and Hamada, H. 　Pre-administration of angiopoietin-1 followed by VEGF induces functional and mature vascular formation in a rabbit ischemic model. J. Gene Med., 5(11):994-1004, 2003.

17. Takahashi K, Ito Y, Morikawa M, Kobune M, Huang J, Tsukamoto M, Sasaki K, Nakamura K, Dehari H, Ikeda K, Uchida H, Hirai S, Abe T and Hamada H Adenoviral delivered angiopoietin-1 reduces the infarction and attenuates the progression of cardiac dysfunction in the rat model of acute myocardial infarction. Mol. Ther. 8(4):584-592, 2003.

骨髄幹細胞を用いた再生医療

18. Kawano Y, Kobune M, Yamaguchi M, Nakamura K, Ito Y, Sasaki K, Takahashi S, Nakamura T, Chiba H, Sato T, Matsunaga T, Azuma H, Ikebuchi K, Ikeda H, Kato J, Niitsu Y and Hamada H. Ex vivo　expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitor cells using a coculture system with human telomerase catalytic subnit (hTERT)-transfected human stromal cells. Blood, 101(2): 532-540, 2003.

19. Tsuda H, Wada T, Ito Y, Uchida H, Dehari H, Nakamura K, Sasaki K, Kobune M, Yamashita T and Hamada H. Efficient BMP2 gene transfer and bone formation of mesenchymal stem cells by a fiber-mutant adenoviral vector. Mol. Ther., 7(3): 354-365, 2003.

20. Kurozumi, K., Nakamura, K., Tamiya, T., Kawano, Y., Kobune, M., Hirai, S., Uchida, H., Sasaki, K., Ito, Y., Kato, K., Honmou, O., Houkin, H., Date, I., and Hamada, H. BDNF gene-modified mesenchymal stem cells promote functional recovery and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Mol. Ther. In press, 2003.　