page2

札幌医科大学医学部

分子医学研究部門　　近況と話題

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2003年5月20日更新

腫瘍の特異的標的化を目指した遺伝子治療法の開発　2001-2003の研究のまとめ

文科省特定研究、がん治療　A03、評価用の資料を作成しました。今年の７月２日に東京で発表会が開かれます。そのためのアブストラクトです。Ａ４用紙２枚にきちんと収めました。今回の発表は、３年間のまとめ、ということで、ハイライトを箇条書きにしてみました。アデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の研究も、これからいよいよ臨床研究の段階かな、と感じます。一方で、がんの治療で、これで打ち止めというところが見いだせないため、いつも、いつも、ブレークスルーとなるような冒険的な基礎研究をパワフルに続けなくてはならないのです。

研究代表者（所属・職名）　濱田　洋文（札幌医科大学・教授）

研究目的

本研究では、標的細胞に対して高い特異性を持ち、しかも高効率で遺伝子を導入・発現させることが可能な、新規アデノウイルスベクターの開発を目指す。さらに、細胞増殖・アポトーシス関連遺伝子・免疫制御遺伝子、などの治療遺伝子を組み込んで、がんに対して高い治療効果を得ることを目的とする。

成果・考察

１） Ad5本来の受容体であるCARと結合しないAd40の短いファイバー (F40S) を有するキメラアデノウイルスをベースとして用いることにより、in vivoでの腫瘍組織への選択性の向上が得られた。Adv-F40Sは肝臓への取り込みは従来型の50分の１以下、肝臓以外の組織に対しても親和性は見られなかった。F40Sは、ノブがCAR受容体に結合しないことに加え、さらにF40Sのシャフトが肝臓に取り込まれやすいペプチドモチーフを欠如するために、肝臓への遺伝子導入（バックグラウンド）が少ないベクターになった。

２）NG2プロテオグリカンの発現はメラノーマ、グリオーマなどの悪性腫瘍とその腫瘍血管に限局することが報告されており、腫瘍標的化のターゲット候補である。NG2を標的とするペプチドモチーフTAASGVRSMH (TAA)を含んだF40S/TAA変異型アデノウイルスを作成し、NG2を高発現するA375メラノーマやA172グリオーマの選択的標的化を試みている。

３）インテグリンを標的としたF/RGD 変異型アデノウイルスを用いて、悪性黒色腫、口腔・咽喉頭領域の扁平上皮癌、膀胱癌などで高い治療効果が得られた。

４）F/RGD 変異型アデノウイルスによって、骨髄由来の間葉系幹細胞MSCにも高い遺伝子導入効率が得られた。サイトカイン遺伝子導入MSCを用いて、浸潤性の高いグリオーマに対する脳内腫瘍治療実験を行ったところ、MSC細胞は、グリオーマ細胞塊の辺縁に添って拡がり、強い抗腫瘍効果が得られた。悪性神経膠腫に選択的なDDSとして有望である。

５）現在、F/RGD アデノウイルスの臨床への応用を目指して各種ベクターを作成し、安全性の評価を進めている。ウイルスの作成に当たっては、アデノウイルスの左端から357bpと右端全長を含むプラスミドpAx3、pAx4を作成し、１個のプラスミドDNAのトランスフェクションのみでウイルスを作成することにより、E1などの混入のない、安全性の高いベクター作成システムとしている。

６）E1A変異とE1B55k欠失を併用すると、腫瘍特異性がさらに高まった殺腫瘍アデノウイルスとなる。これに外被ファイバーの修飾を施して、感染効率を高めたベクターを開発した。また、E1Aを腫瘍組織特異的プロモーター（CEAprなど）でドライブすることにより、さらに腫瘍選択性の高い治療効果が得られた。これらの基礎実験結果をもとに、進行膵癌に対する臨床研究を準備している。

主要発表

1. Nakamura T, Sato K, and Hamada H. Reduction of natural adenovirus tropism to the liver by both ablation of fiber-Coxsackievirus and adenovirus receptor interaction and use of replaceable short fiber. J Virol. 77(4): 2512-2521, 2003.

2. Dehari H, Ito Y, Nakamura T, Kobune M, Sasaki K, Yonekura N,Kohama G, and Hamada H. Enhanced antitumor effect of RGD fiber-modified adenovirus for gene therapy of oral cancer. Cancer Gene Therapy, 10(1): 75-85, 2003.

3. Uchida H, Shinoura N, Kitayama J, Watanabe T, Nagawa H, Hamada H. 5-Fluorouracil efficiently enhanced apoptosis induced by adenovirus- mediated transfer of caspase-8 in DLD-1 colon cancer cells. 　J Gene Med. 5(4): 287-299, 2003.

4. Desaknai S, Lumniczky K, Esik O, Hamada H, Safrany G. Local tumour irradiation enhances the anti-tumour effect of a double-suicide gene therapy system in a murine glioma model. J. Gene Med., 5(5): 377-385, 2003.

5. Kawano Y, Kobune M, Yamaguchi M, Nakamura K, Ito Y, Sasaki K, Takahashi S, Nakamura T, Chiba H, Sato T, Matsunaga T, Azuma H, Ikebuchi K, Ikeda H, Kato J, Niitsu Y, Hamada H. Ex vivo　expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitor cells using a coculture system with human telomerase catalytic subnit (hTERT)-transfected human stromal cells. Blood 101(2): 532-540, 2003.

6. Tsuda H, Wada T, Ito Y, Uchida H, Dehari H, Nakamura K, Sasaki K, Kobune M, Yamashita T, Hamada H. Efficient BMP2 gene transfer and bone formation of mesenchymal stem cells by a fiber-mutant adenoviral vector. Mol. Ther. 7(3): 354-365, 2003.

7. Huang J et al. and Hamada H. Myocardial injection of CA promoter-based plasmid mediates efficient transgene expression in rat heart. J. Gene Medicine, in press, 2003.

8. Yamauchi A et al. and Hamada H. Pre-administration of angiopoietin-1 followed by VEGF induces functional and mature vascular formation in a rabbit ischemic model. J. Gene Med. in press, 2003.

9. Uchida H, Shinoura N, Kitayama J, Watanabe T, Nagawa H, and Hamada H. Caspase-8 gene transduction augments radiation-induced apoptosis in DLD-1 cells. Biochem Biophys Res Commun. 292(2): 347-354, 2002.

10. Yamamoto S., et al. and Hamada H. Reduced transduction efficiency of adenoviral vectors expressing human p53 gene by repeated transduction into glioma cells in vitro. Clin Cancer Res. 8(3): 913-921, 2002.

11. Nakamura T, Sato K. and Hamada H. Effective Gene Transfer to Human Melanomas via Integrin-Targeted Adenoviral Vectors. Hum. Gene Ther. 13(5): 613-626, 2002.

12. Shinoura N, Sakurai S, Shibasaki F, Asai A, Kirino T, and Hamada H. Co-transduction of Apaf-1 and caspase-9 highly enhances p53-mediated apoptosis in gliomas. Br J Cancer. 86(4): 587-595, 2002.

13. Xia DJ, Zhang WP, et al., Hamada H, and Cao X. Lymphotactin cotransfection enhances the therapeutic efficacy of dendritic cells genetically modified with melanoma antigen gp100. Gene Ther., 9(9): 592-601, 2002.

14. Takahashi M, Sato T, Sagawa T, et al. Hamada H, Kato J, Niitsu Y. E1B-55K-Deleted Adenovirus Expressing E1A-13S by AFP-Enhancer/Promoter Is Capable of Highly Specific Replication in AFP-Producing Hepatocellular Carcinoma and Eradication of Established Tumor. Mol. Ther., 5 (5 Pt 1): 627-634, 2002.

15. Shimizu, T., Shimada, H., Ochiai, T., and Hamada, H. Enhanced growth suppression in esophageal carcinoma cells using adenovirus-mediated fusion gene transfer (uracl phosphoribosyl-transferase and herpes simplex virus thymidine kinase). Cancer Gene Therapy, 8(7): 512-521, 2001.

16. Shinoura N, Sakurai S, Asai A, Kirino T, and Hamada H. Over-expression of APAF-1 and caspase-9 augments radiation-induced apoptosis in U-373MG glioma cells. Int J Cancer. 15:93(2): 252-261, 2001.

17. Shinoura N, Sakurai S, Asai A, Kirino T, and Hamada H. Caspase-9 transduction overrides the resistance mechanism against p53-mediated apoptosis in U-87MG glioma cells. Neurosurgery. 49(1): 177-186; discussion 186-7, 2001.

18. Shinoura N, Furitsu T, Asai A, Kirino T, and Hamada H. Co-transduction of p27Kip1 strongly augments Fas ligand- and caspase-8-mediated apoptosis in U-373MG glioma cells. Anticancer Res., 21(5): 3261-3268, 2001.

19. Shinoura, N., Sakurai, S., Asai, A., Kirino, T., and Hamada, H. Co-transduction of apaf-1 and caspase-9 augments etoposide-induced apoptosis in U-373MG glioma cells. Jpn J Cancer Res., 92(4): 467-474, 2001.

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊＊＊＊＊＊＊